VEGF转基因绒山羊的检测

【摘要】血管内皮生长因子(vascularendothelialcellgrowthfactor,VEGF),在人和动物的毛囊中可以表达,是毛乳头细胞的一种自分泌生长因子。研究表明,VEGF与动物毛囊发育和毛发生长密切相关。在VEGF转基因绒山羊的生产中,影响目的基因表达及其作用机理仍有待进一步检测和探索。本实验室在2012年通过体细胞克隆技术得到了一批转VEGF基因的转基因绒山羊。本研究通过对产绒量显著提高的一只转基因绒山羊(37号)和一只产绒量没有明显改变的转基因绒山羊(41号)进行测定,同时与来自同一细胞系的体细胞克隆羊(5号)进行对比,确定目的基因VEGF在转基因绒山羊体内的表达情况,进而为深入探索目的基因的作用机理提供实验依据。本研究在DNA、RNA、蛋白以及宏观水平对这三只转基因绒山羊进行检测,得到如下主要结果：1.对三只绒山羊进行产绒量检测,37号羊抓绒后体重为37.5kg,产绒量为1095g；41号羊抓绒后体重为35kg,产绒量为460g；5号体细胞克隆羊抓绒后体重为36.5kg,产绒量为450g。·2.通过PCR初步鉴定,37号羊和41号羊均为阳性,然后进行southernbolt检测,与PCR结果吻合。3.本实验以Glucagon基因为内参,采用绝对定量PCR法检测目的基因的拷贝数。标准曲线为：Log2N(拷贝数)=-0.3881△Ct+0.3093(R2=0.9983,p<0.001),计算得到37号和41号转基因绒山羊的拷贝数分别为0.82和0.97,结果显示两只转基因羊的目的基因均为单拷贝。4.以GAPDH基因为内参,对两只转基因绒山羊进行realtimePCR和westernblot检测,其结果与体细胞克隆羊进行对比。结果显示,在37号羊中,VEGF在皮肤中的RNA表达量和蛋白表达量分别为3.27和1.82倍,在血液中RNA表达量和蛋白表达量分别为0.49和1.02倍；在41号羊中,VEGF在皮肤中的RNA表达量和蛋白表达量分别为0.93和1.16倍,在血液中RNA表达量和蛋白表达量分别为0.24倍和0.86倍。5.对37号、41号和5号羊皮肤做石蜡切片纵切,并进行免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下成像,并用显微镜自带分析软件对毛囊及其周围组织的荧光强度进行测量。结果显示,VEGF的荧光强度在37号羊的初级毛囊中是5号体细胞克隆羊的1.21倍,在41号羊中为1.07倍。6.对37号、41号和5号羊皮肤做冰冻切片横切,并进行HE染色。结果显示,在一个毛囊簇中转基因绒山羊的初级毛囊数量为3个没有变化,而次级毛囊的数量有所变化。37号羊的绒毛比为13.78,41号羊的绒毛比为11.78,5号体细胞克隆羊的绒毛比则为9.89。以上结果显示,VEGF转基因绒山羊的目的基因具有皮肤组织表达特异性,且目的基因在皮肤组织的高表达可显著提高羊绒产量。本实验初步建立了对转基因动物各个水平检测的体系,为今后对转基因动物进行更深层次的研究打下了基础。
【作者】毕兆伟；
【导师】刘东军；
【作者基本信息】内蒙古大学，动物学，2014，硕士
【关键词】转基因绒山羊；PCR；RealtimePCR；Southernbolt；拷贝数；Western；blot；冰冻切片；石蜡切片；

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